Vienos DNR molekulės sekos nustatymas

„Helicos BioSciences“ biurų kampe Kembridže, MA, ekrane, panašaus į milžinišką šaldytuvą, mirksi atgalinis skaičiavimas: 10 dienų, penkios valandos ir 51 minutė, kol baigs nuskaityti visos DNR seką. buvo į jį įvestas. Didelio našumo mašina, sudėtinga vamzdžių, lazerių ir cheminių medžiagų konfigūracija, turi dvi plokšteles, kurių kiekvienoje yra 25 mikroskysčių kanalai. Kiekvienas kanalas gali laikyti ir nustatyti atskirą DNR mėginį. Lygiagrečiai nustatant mėginių seką, aparatas užtrunka vos vieną valandą, kad nuskaitytų 1,3 milijardo cheminių bazių – žinomų kaip A, C, T ir G – sudarančių DNR grandinę.

„HeliScope“ yra pirmasis komercinis aparatas, kuriame sekvenuojama viena DNR dalis, o ne daug kartų nukopijuota. Kiekviena srauto ląstelė (aukščiau) turi 25 kanalus, kurių kiekvienas gali laikyti 16 milijonų DNR gijų, skirtų sekai nustatyti. Ląstelės paviršiuje esanti danga leidžia ją švariai nuplauti tarp reakcijų.

Pavadintas HeliScope, tai pirmasis komercinis instrumentas, galintis tiesiogiai nuskaityti vienos tokios krypties seką, o tai suteikia galimybę pasiekti precedento neturintį greitį. Tiesą sakant, sako Stephenas Quake'as, Stanfordo universiteto bioinžinierius, kuris 2003 m. įkūrė įmonę, „Helicos“ iš esmės sukūrė greičiausią pasaulyje DNR sekvenavimo įrenginį. Nors neaišku, ar mašina sukurs visą seką greičiau nei konkuruojančios sistemos (sekvenavimo mašinos sugeneruoti duomenys vis tiek turi būti analizuojami ir sujungiami, tai yra daug skaičiavimo reikalaujanti užduotis), Quake'as teigia atveriantis visiškai naujas sritis. tyrimai.

Ši istorija buvo mūsų 2008 m. liepos mėn. numerio dalis

• Žr. likusią numerio dalį
• Prenumeruoti

Šių metų pradžioje pristatytas „HeliScope“ prisijungia prie intensyvių lenktynių dėl greitesnių ir pigesnių sekos nustatymo technologijų. Žmogaus genomo sekos nustatymo kaina pastaraisiais metais sumažėjo – nuo ​​300 mln. USD, kuriuos Žmogaus genomo projektas išleido pirmajam projektui, iki mažiau nei 100 000 USD. Pigios sekos taikymo galimybės yra beveik neribotos – nuo ​​ligų diagnostikos iki tyrimų, kurių metu galima gauti mikrobus, sukurtus biokurui ar vaistams gaminti.

Kitose šiuo metu naudojamose pažangiose sekos nustatymo technologijose, įskaitant „Illumina“, „Applied Biosystems“ ir „454 Life Sciences“ (kurias Roche įsigijo praėjusiais metais), sekvenuojama DNR turi būti daug kartų amplifikuota arba nukopijuota; tada kopijos skaitomos vienu metu, kad būtų lengviau aptikti fluorescencinius signalus, nurodančius kiekvienos DNR raidės padėtį. Vienos molekulės sekos nustatymas praleidžia kopijavimo žingsnį, o tai reiškia, kad daug daugiau unikalių mėginių gali būti supakuoti į vieną sekos nustatymo eksperimentą.

Multimedija

• Žiūrėkite „Helicos Biosciences“ vienos DNR molekulės sekos nustatymo procesą.

• Stephenas Quake'as, „Helicos Biosciences“ įkūrėjas, kalba apie sekos nustatymą.

Be to, vienos molekulės sekos nustatymas gali sudaryti išsamesnį genomo vaizdą. Taip yra todėl, kad kai DNR amplifikuojama, didesnė tikimybė, kad kai kurios eilutės bus sėkmingai nukopijuotos nei kitos, todėl didesnė tikimybė, kad jos bus pavaizduotos galutinėje sekoje. Taip pat retos genetinės mutacijos gali likti nepateiktos, nes jos nenukopijuojamos. Jei dienos pabaigoje galite tiesiog įdėti vieną DNR grandinę ant platformos ir tiesiogiai ją sekti, tai yra didžiulis pranašumas, sako Elaine R. Mardis, Vašingtono universiteto Genomo centro direktorė Sent Luise.

Pabudimas naktį
Naudojant Helicos technologiją, sekvenuojama DNR pirmiausia susmulkinama į trumpus maždaug 200 bazių ilgio gabalus ir įšvirkščiama į srauto ląstelę – specializuotą stiklelį. Srauto ląstelė yra padengta mažais DNR fragmentais, kurie yra skirti sugauti fragmentus jiems plūduriuojant ir pritvirtinti juos vietoje. Imobilizuotos DNR dalys yra paženklintos fluorescenciniu būdu, kad jų padėtis po fluorescenciniu mikroskopu būtų užfiksuota fotoaparatu. Beveik milijardą DNR vienetų galima išanalizuoti atliekant vieną sekos nustatymo eksperimentą, palyginti su maždaug 400 000–50 milijonų kitų technologijų atveju.

Tada srauto ląstelė įstatoma į HeliScope, kur mikroskopas yra apsuptas 400 svarų Vermonto granito. Papildomas svoris neleidžia vibracijai trukdyti signalams, kuriuos turi aptikti įrenginys. Sudėtinga optinė sistema ir vamzdelių raizginys supa mikroskopą, jungiantį jį su miniatiūriniu šaldytuvu, pripildytu specialiai pagamintų cheminių medžiagų butelių.

Kai mokslininkas įjungia mašiną, prasideda tiksliai choreografuotas skysčių šokis. Į ląstelę patenka fermentas, vadinamas DNR polimeraze ir vieno tipo fluorescenciniu būdu pažymėtos bazės, tarkime, A. Fermentas priverčia tuos As užimti savo vietas augančiose DNR grandinėse, kurios papildo mėginiuose esančias grandines. (Kiekvienas iš keturių pagrindų gali susieti tik su vienu kitu pagrindu, todėl pridėtas A turi būti priešais esamą T, o C priešais G.) Kai fluorescencine žyma pažymėta bazė bus įtraukta į naują giją, HeliScope kamera gali pastebėkite jo skleidžiamą šviesą. Vaizdo aparatas aptinka stulpelį – 200 nanometrų šviesos kūgį – nuo ​​vienos [bazės] integracijos į vieną DNR grandinę, sako Steve'as Lombardi, Helicos prezidentas.

Kituose pažangiuose sekos nustatymo metoduose naudojamas panašus metodas, žinomas kaip sekos nustatymas sintezės būdu. Tačiau skirtingai nei šios technologijos, HeliScope gali atskirti nepastiprintą fluorescencinį vienos bazės signalą, užimantį vietą augančioje DNR grandinėje. Vienas iš raktų į šį gebėjimą yra nelipni medžiaga, kurią sukūrė bendrovė, kuri padengia srauto elemento paviršių ir leidžia jį švariai nuplauti tarp reakcijų: dėl likusių fluorescencinių bazių būtų sunkiau tiksliai aptikti atskiras sekos nustatymo reakcijas. Turite įsitikinti, kad prie paviršiaus nepriliptų jokių papildomų bazinių molekulių, sako Patrice'as Milosas, „Helicos“ vyriausiasis mokslo darbuotojas. Tai buvo vienas didžiausių ankstyvųjų iššūkių. Po kiekvieno ciklo fluorescenciniai žymekliai nupjaunami nuo naujai įterptų bazių, o likusios cheminės medžiagos nuplaunamos. Procesas kartojamas paeiliui su kiekviena iš keturių bazių.

„HeliScope“ kas sekundę generuoja didžiulį neapdorotų duomenų kiekį. Visą DNR, kurią galima įkelti į dvi srauto ląsteles, nuskaityti užtrunka nuo penkių iki dešimties dienų; sekos nustatymui, tai yra 400 milijonų DNR grandžių vienoje ląstelėje, kuri gali sukurti 20 milijardų bazių vertės naudoti sekos. Mokslininkai pakrauna mašiną, paspaudžia mygtuką ant jos veido ir išeina. Tačiau sekvenavimo apsėstasis gali naudotis internetu norėdami patikrinti mašinos eigą vidury nakties – tai įprastas reiškinys „Helicos“.

Kai HeliScope sukuria fluorescencinių nuotraukų seriją, kartu esantis duomenų apdorojimo centras jas paverčia raidžių eilutėmis. Programinė įranga įklijuoja šias dalis, kad sudarytų ilgesnę seką.

Trūksta mutacijų
Straipsnyje, paskelbtame m Mokslas Šių metų pradžioje mokslininkai pranešė apie savo HeliScope naudojimą M13 viruso genomui sekti, o tai yra svarbus įrodymas, kad vienos molekulės sekos nustatymas gali būti naudojamas norint nuskaityti ir surinkti viso genomo seką. (Maždaug 7000 bazinių porų ilgio, M13 viruso genomas yra mažytis – apie milijoną žmogaus dydžio.) Technologija tokia nauja, kad dar neaišku, kokioms programoms ji geriausiai tiktų. Tačiau kai kurie mokslininkai mano, kad vienos molekulės sekos nustatymas gali būti ypač svarbus norint suprasti, kaip genetinės variacijos prisideda prie ligų. Galų gale, kai kurios retos su liga susijusios mutacijos galėjo būti praleistos ankstesniuose genominiuose tyrimuose, nes jos nebuvo nukopijuotos amplifikacijos proceso metu.

„Helicos“ vis dar tobulina technologiją, kuria chemiją, kuri galėtų pagreitinti sekos nustatymo reakcijas ir leisti daugiau DNR dalių pritvirtinti prie srauto ląstelės. Kartu su kitais pagrindiniais šios srities žaidėjais bendrovė tikisi pateikti visą genomo seką už 1000 USD, o tai reikštų kažko visiškai naujo medicinoje pradžią: individų galimybę pasiekti savo genominę informaciją.

Emily Singer yra VAIKAI biotechnologijų ir gyvybės mokslų redaktorius.

paslėpti