Sekos nustatymas blykste

2007 m. vasario 6 d. 454 Life Sciences vadovai parodė 78 metų Jamesui Watsonui pirmąjį jo paties genomo projektą. Čia buvo kažkas visiškai poetiško. Watsonas, žinoma, prieš 45 metus buvo laimėjęs Nobelio premiją už vaidmenį atrandant dvigubą spiralę DNR; jis taip pat buvo pagrindinis Žmogaus genomo projekto, kuris 2003 m. baigtas, iniciatorius per 13 metų išleido beveik 3 mlrd. Dabar 454 peržengė žingsnį toliau nei šis megaprojektas, kuriame buvo sujungtos daugelio žmonių DNR, kad būtų nustatyta genetinė seka, prilygstanti žmogaus modeliui. Bendrovė ir jos vadinamasis naujos kartos sekos sudarymo aparatas vienas perskaitė genetinį kodą individo, kurio darbas padarė tiek daug, kad šis pasiekimas būtų įmanomas.

454 darbuotojas Jonathanas Rothbergas mano, kad jo mašinos padarys sekos nustatymą taip pigų ir greitą, kad bus praktiška nuskaityti asmenų genomus.

Tačiau Jonathanas Rothbergas, kuris įkūrė 454 Branforde, CT, svajodamas sukurti sekvenavimo aparatą, kuris būtų efektyvesnis nei turimas Žmogaus genomo projektui, pasakodamas apie savo susitikimą su Vatsonu, nemini poezijos. Greičiau jis kalba apie pinigus, greitį ir ateitį, kurioje paprasti žmonės nešiojasi savo asmeninius genomus diskuose – tai vis labiau tikėtinas scenarijus. Jimą Watsoną padaryti mums kainavo 200 000 USD, pažymi Rothbergas. Ir tai darydavome dažniausiai gruodį ir sausį.

Ši istorija buvo mūsų 2007 m. gegužės mėn. numerio dalis

• Žr. likusią numerio dalį
• Prenumeruoti

Rothbergas, dabar pirmininkaujantis 454 direktorių tarybai, pabrėžia, kad projektas „Jim“ tebėra nebaigtas ir jam reikės daugiau laiko ir pinigų. Nuo vasario mėnesio bendrovė Watsono DNR sekvenavo tik tris kartus (kiekvienas paleidimas padidino tikslumą ir užpildė spragas); Norint sukurti galutinę žmogaus genomo projekto sekos juodraštį, reikėjo devynių leidimų. Bet vis tiek.

Rothbergo įmonė yra tik viena iš kelių, įskaitant „Illumina“ iš San Diego ir „Applied Biosystems“ iš Foster City, Kalifornijos, kurianti mašinas, galinčias iššifruoti DNR greičiau nei bet kada anksčiau. Ir lygiai taip pat, kaip kompiuterių energijos kaina smarkiai sumažėjo dėl nuolat didėjančio tranzistorių tankio lustuose, DNR sekos nustatymo kaina sparčiai krito atsiradus šioms mašinoms. Šiandien žmogaus genomo, iššifruoto naudojant žmogaus genomo projekte naudojamo tipo sekvenerius, kaina būtų 25–50 mln. Su šiandien prieinamais naujos kartos įrenginiais jis nukrenta iki maždaug 1 mln. USD, o iki 2008 m. gali siekti 100 000 USD.

Multimedija

• Peržiūrėkite sekos paslapčių grafiką.

Kaip parodė kompiuterių istorija, didesnė apdorojimo galia už mažiau pinigų gali sukelti nenumatytų programų. Įgyvendinus Žmogaus genomo projektą, mokslininkai susidūrė su sunkiais finansiniais sprendimais, kuriuos genomus sekti sekti: šimpanzės ar makakos, karvės ar delfino, ryžių ar maniokos. Naujos mašinos leidžia sekti beveik viską, kas domina. Į duomenų bazes patenkant vis daugiau sekos duomenų, atsiveria visiškai naujos tyrimų sritys. Dabar mokslininkai turi precedento neturintį gebėjimą palyginti rūšis, atskleisdami viską nuo evoliucinių klausimų iki genetinių priežasčių, lemiančių individualius atsparumo ligoms ir jautrumo skirtumus. Tyrimai, atlikti naudojant 454 mašinas ir paskelbti geriausiuose žurnaluose, apima dalinį neandertaliečio genomo sekos nustatymą ir naujų vėžį sukeliančių genetinių mutacijų testų kūrimą – technologijų, kurios gali padėti gydytojams pritaikyti gydymą savo pacientams.

Praėję metai buvo įdomiausias genomikos laikotarpis nuo Žmogaus genomo projekto laikų, sako Ericas Landeris, pirmasis projekto pirmojo paskelbto žmogaus genomo projekto autorius ir dabar Plačiojo genominės medicinos instituto Kembridže, MA vadovas. . Sekos nustatymas tampa pakankamai pigus ir pakankamai galingas, kad jį būtų galima pritaikyti bet kuriai problemai. Tai stovi lauke ant galvos. Francisas Collinsas, vadovavęs Nacionalinių sveikatos institutų žmogaus genomo projektui, prognozuoja, kad naujosios sekos nustatymo technologijos turės didelių pasekmių biomedicininių tyrimų ateičiai ir galiausiai medicinos praktikai.

Unikalus sprendimas
Jonathano Rothbergo biuras yra užkandinės tema: raudonos ir juodos šachmatų plytelių grindys, raudonos Naugahyde dengtos chromuotos kėdės ir sofa su rankenomis, imituojančiomis 1959 m. „Cadillac“ galinę dalį, su monstrų uodegos pelekais ir kulkos formos galiniais žibintais. . Vietoj rašomojo stalo jis turi valgomojo barą su baro kėdėmis. Kai kuriose lentynose rikiuojasi jam priklausančio Konektikuto vynuogyno vyno buteliai. Už langų yra Long Island Sound. Vieta rėkia Aš esu unikalus . Ir toks yra Rothbergas. 1991 m., baigdamas biologijos mokslų daktaro laipsnį Jeilio universitete, jis įkūrė CuraGen – vieną pirmųjų kompanijų, kuriančių vaistus, pagrįstus genomika. Be CuraGen ir 454 Life Sciences, jis įkūrė vaikų ligų tyrimo institutą ir dar vieną biotechnologijų įmonę RainDance Technologies, kuri sukūrė vadinamąsias skystąsias grandines, skirtas eksperimentams efektyvinti manipuliuojant nedideliais kiekiais. skysčio. Ir visa tai sulaukus 43 metų.

Iš tiesų, domėjimasis kiekvieno žmogaus unikalumu galiausiai paskatino jį pabandyti sukurti sekvencinį įrenginį, kurį, jo manymu, vieną dieną genomo tikrinimas taps toks pat įprastas, koks yra dabar kraujo tyrimai. Rothbergas laiko 454 aparato, stiklinio stiklelio su 1,6 milijono miniatiūrinių šulinių, kurių kiekvienas yra maždaug 50 mikrometrų pločio (maždaug pusė žmogaus plauko pločio) ir 55 mikrometrų gylio, žarnas. Būtent šis lustas leidžia mašinai taip greitai nustatyti DNR seką, nes kiekviename šulinyje gali būti atlikta atskira cheminė reakcija.

Atliekant genų seką, naudojamasi tuo, kad dvi DNR spiralės grandinės yra viena kitą papildančios: iš keturių cheminių bazių adenino, guanino, timino ir citozino, kurie kiekvienoje grandinėje surišti įvairia tvarka, adeninas poruojasi tik su timinu ir guaninas tik su citozinu. Taikant dažniausiai naudojamą sekos nustatymo metodą, kuris paremtas prieš 30 metų Kembridžo universiteto Fredericko Sangerio sukurta schema, DNR fragmentai yra atskiriami į atskiras grandines ir veikiami laisvųjų nukleotidų, kurie jungiasi su pradiniais As, Cs, Ts, ir Gs, kad būtų sukurtos naujos viena kitą papildančios kryptys. Šios gijos skiriasi ilgiu, nes kai kurie laisvieji nukleotidai buvo modifikuoti, kad reakcija nesitęstų; kai viena iš šių bazių prisijungia prie savo tikslo, grandinė nustoja augti. Ir kiekvienas iš šių keturių tipų grandinės baigiklių turi skirtingą fluoroforą, kuris fluorescuoja, kai į jį patenka lazerio spindulys. Elektros srovė atskiria sruogelius pagal dydį, o lazeris nuskaito spalvas, kad nustatytų, kuri buvo paskutinė bazė, pridėta prie kiekvienos grandinės, ir nurodo seką. Didžioji dauguma laboratorijų, kurios šiandien atlieka seką, naudoja „Applied Biosystems“ pagamintą aparatą, kuris per dieną išleidžia apie du milijonus bazių.

Naujausia sekvencija iš 454 per dieną gali nuskaityti 300 mln.

Taikant 454 metodą išvengiama kelių daugiau laiko reikalaujančių įprastinio sekos nustatymo etapų, pvz., sruogų atskyrimo pagal dydį. Skirtingai nuo Sanger sekos, ji nenutraukia grandinių: įrašo bazes, kai jos pridedamos prie augančios krypties. Pirma, DNR molekulė atsitiktinai supjaustoma į skirtingus ilgius. Tada kiekvienas fragmentas išardomas į atskiras sruogas ir kiekviena sruogelė pritvirtinama prie atskiro mažo karoliuko. Biocheminis procesas nukopijuoja atskiras sruogas, todėl iš kiekvieno karoliuko iškyla 10 milijonų klonų. Tada kiekvienas karoliukas supakuojamas į vieną iš 1,6 milijono šulinių. As, Cs, Ts ir Gs nuosekliai plauna šulinius, kad susintetintų naujas papildomas sruogas.

Štai tikrai protinga dalis: naudojant metodą, kurį pirmą kartą aprašė Pål Nyrén ir bendradarbiai iš Švedijos Karališkojo technologijos instituto, 454 sekvenatorius akimirksniu užfiksuoja, kada į kiekvieną grandinę pridedama bazė, išnaudodama faktą, kad jungimosi reakcija išskiria cheminę medžiagą, vadinamą pirofosfatu. 454 aparato šuliniuose pirofosfatas sugaunamas cheminės kaskados, kuri baigia blykstelėti ant fermento luciferazės (kurios natūraliai pasitaiko ugniagesiuose) ir išspinduliuoja šviesos pliūpsnį. Standartinis įkrovimu sujungtas įtaisas, naudojamas skaitmeniniuose fotoaparatuose ir teleskopuose, aptinka kiekvieną blykstę, nuskaitydamas kiekvieno fragmento As, Cs, Ts ir G seką. Procesas gali nuskaityti apie 200–300 bazių iš eilės. Kaip ir atliekant įprastą seką, kompiuteriai ieško atitinkančių sekų vieno fragmento pabaigoje ir kito pradžioje, sujungdami fragmentus teisinga tvarka.

2005 m. spalį 454 rinkai pristatytas sekveneris turėjo keletą rimtų apribojimų. Jis galėjo nuskaityti tik 100 bazių iš eilės (kuo ilgesnis bazių ruožas kiekviename sekvenuotame fragmente, tuo lengviau surinkti visą genomą), taip pat buvo sunku tiksliai atvaizduoti pasikartojančius ruožus – tarkime, šešis As atgal. Tačiau Rothbergas sako, kad 454 filosofija buvo Get it out early; priimti jį. Bendrovė pirmiausia nusitaikė į ankstyvuosius naudotojus, tokius kaip „Broad's Lander“, tikėdamasi, kad jie netrukus paskelbs išvadas, pagrįstas sekvenatoriumi. Pirmiausia turite sulaukti ankstyvųjų vaikinų, bet kiti vaikinai, pasekėjai, yra ten, kur yra rinka, sako Rothbergas. Ir jie skaitė recenzuojamus straipsnius.

neandertaliečiai
Vienas ankstyvojo pritaikytojo dokumentas, kuris sulaukė didelio mokslininkų ir visuomenės dėmesio, buvo neandertaliečių DNR tyrimas, kuriam vadovavo Svante Pääbo iš Maxo Plancko evoliucinės antropologijos instituto Leipcige, Vokietijoje. Neandertaliečiai, artimiausia šiuolaikiniams žmonėms rūšis, išnyko maždaug prieš 30 000 metų, ir daugiau spėliojimų nei faktų supa jų genetinis ryšys su mumis. Nors Pääbo atliko kai kuriuos ankstesnius tyrimus su neandertaliečių DNR, bet kas, išskyrus pradinę analizę, pasirodė per sunku ir brangu. Problema ta, kad per tūkstančius metų keli žinomi neandertaliečių DNR pavyzdžiai iš fosilijų buvo suskaidyti iki trumpų, maždaug 50–75 bazinių porų fragmentų. Be to, DNR dažnai yra užteršta genetine medžiaga iš mikroorganizmų ir šiuolaikinių žmonių, kurie tvarkė fosilijas. Tačiau Rothbergas tikėjo, kad 454 aparatas gali mažomis sąnaudomis išanalizuoti daug trumpų sekų ir sugeneruoti pakankamai informacijos, kad mokslininkai galėtų atsijoti senovės lobius iš šiukšlių. Rothbergas šaltai vadinamas Pääbo, kuris sutiko bendradarbiauti.

Nustačiusi genų seką iš 70 neandertaliečių kaulų ir dantų mėginių, Pääbo komanda ir tyrėjai iš 454 rado vieną mėginį, kurio amžius yra 38 000 metų, kuriame daugiausia buvo švari DNR. Kaip jie pranešė pernai rudenį paskelbtame dokumente Gamta , jie iš mažiau nei 200 miligramų medžiagos sudarė vieną milijoną bazinių porų, o tai davė užuominų apie tai, ar šiuolaikiniai žmonės ir neandertaliečiai kryžmino ir kada šios dvi rūšys skyrėsi viena nuo kitos. Dar svarbiau, kad dokumentas rodo, kad visų trijų milijardų bazių seka neandertaliečių genome yra įmanoma. Tai gali padėti išspręsti tokias paslaptis, kaip neandertaliečių genetinis gebėjimas kalbėti.

Išsiaiškinus, ar žmonės ir neandertaliečiai susikryžmino, ar net sugebėjo susikalbėti, gali sulaukti daug spaudos ir visuomenės dėmesio, tačiau kitos itin greito DNR sekos nustatymo programos gali turėti daug didesnį poveikį medicinai ir mūsų gyvenimui. Tradicinis sekos nustatymo metodas tiria DNR iš daugelio skirtingų ląstelių. Bet jei viena iš tų ląstelių yra, tarkime, naviko ląstelė, jos seka gali šiek tiek skirtis nuo sveikų ląstelių. Tokiais atvejais kompiuteriai pasirenka dažniausiai randamą seką, o kitas atmeta. Naujos kartos sekvenatoriai, tokie kaip tie, kuriuos parduoda 454, vietoj to klonuoja ir seka atskiras DNR molekules, leidžiančius atlikti itin gilų zondavimą, leidžiantį atrasti retus variantus. (Tradiciniai sekvenavimo įrenginiai taip pat gali analizuoti pavienes molekules, tačiau tai pernelyg brangu.) Vienos molekulės sekos nustatymas medicinai turi milžinišką poveikį. Nors nėra praktiška naudoti įprastą sekos nustatymą, norint išsiaiškinti DNR skirtumus tarp sveikų ir sergančių ląstelių, naujosios mašinos gali lengvai atlikti tokius eksperimentus.

Matthew Meyersonas, klinikinis patologas iš Dana-Farber vėžio instituto Bostone, paskelbė tyrimą, kuriame parodyta, kaip 454 aparatas gali padėti atskleisti su plaučių vėžiu susijusias mutacijas. Dabar prieinami vaistai nuo plaučių vėžio yra skirti genui, kurio seką nustato Meyersonas, ir jis tikisi, kad gydytojai galiausiai geriau supras, kas reaguos į kokius vaistus, sužinoję, ar pacientas turi tam tikrą mutaciją. Įsivaizduoju, kad po kelerių metų visi vėžiu sergantys pacientai turės savo navikus, kuriems bus būdinga vienos molekulės seka, jei technologija ir toliau mažės, sako jis.

Keisdamas šią temą, Jeilio AIDS klinikos gydytojas Michaelas Kozalas prisijungė prie 454, kad atliktų itin gilią ŽIV seką, kad nustatytų, ar yra nedidelės vaistams atsparaus viruso populiacijos. Ankstyvieji technikos bandymai pacientams aptiko maždaug dvigubai daugiau atsparaus ŽIV nei Sangerio seka. Ši informacija taip pat galėtų padėti gydytojams individualizuoti gydymo režimus, o tai padidintų ekonominį efektyvumą. Tai praktiška mūsų sistemoje, sako 454 vyriausiasis mokslininkas Michaelas Egholmas, bendradarbiaujantis su Kozal. Anksčiau tai tiesiog nebuvo įperkama.

MyGenome
George'as Churchas, Harvardo medicinos mokyklos sekos nustatymo pradininkas, sako, kad kaina yra svarbiausia. Pasak jo, per ateinančius kelerius metus jų kainoms krintant, šios mašinos taps demokratizuojančia jėga, dėl kurios tradiciniai sekvenatoriai bus visiškai pasenę, panašiai kaip asmeniniai kompiuteriai išstūmė pagrindinius kompiuterius. Ir tai sukels programas, kurių niekas dar negali suprasti. Jei vis dar dirbtume su pagrindiniais kompiuteriais, daug įdomių dalykų neįvyktų, sako jis.

Churchas, kuris devintojo dešimtmečio viduryje buvo vienas iš tyrėjų, pasiūliusių Žmogaus genomo projektą, yra vienas iš nedaugelio biologų, kurių laboratorinė įranga apima ant stalo pritvirtintą spaustukų rankeną ir gręžimo presą. Jis naudoja tokią įrangą, kad sukurtų savo naujos kartos sekvenerius, kurių šiuo metu jo laboratorijoje yra aštuoni (žr. TR35, 2006 m. rugsėjo/spalio mėn.) . Įsitikinęs, kad įmonės per daug apmokestina savo mašinas, jis stengiasi laisvai dalytis savo žiniomis su visais suinteresuotais kolegomis. Jis lygina savo filosofiją su „wiki“ ir „Linux“ mentalitetu, sakydamas: „Jei susirenka skruzdėlių krūva, jos gali perkelti guminį augalą“.

Didžioji Bažnyčios vizija yra nukreipti pigų As, Cs, Ts ir G potvynį į tai, ką jis vadina asmeniniu genomo projektu. Žmogaus genomo projekte tyrėjai gavo DNR iš kelių žmonių, kurių kiekvienas privatumo sumetimais lieka anonimas. Taigi galutinė seka vaizduoja sudėtinį asmenį, turintį skirtingos genetinės kilmės ir medicininių istorijų konglomeratą. Church nori, kad jo asmeninio genomo projektas iššifruotų asmenų DNR, kurie taip pat savanoriškai pateiks savo medicininius įrašus. Visus gautus duomenis jis paskelbs internete. Galų gale, jis įsivaizduoja, milijonai žmonių prisijungs prie projekto, paskelbdami savo sekas, medicininius įrašus ir, jei pasirinks, net veido nuotraukas internete. Tada visas pasaulis turės prieigą prie visų duomenų, kurių jam reikia norint laisvai patikrinti hipotezes.

Nors Bažnyčia gavo didelį finansavimą iš Nacionalinių sveikatos institutų sekos nustatymo technologijoms kurti, dėl etinių, teisinių ir socialinių klausimų, susijusių su asmeniniu genomo projektu, NIH negalėjo jo paremti, nepaisant teigiamos paraiškos dėl dotacijos peržiūros 2005 m. rugpjūčio mėn. Kai tik gavau patvirtinimą, NIH susijaudino, ir nebūtinai gerąja prasme, sako jis. Jis bandė spręsti privatumo ir konfidencialumo problemas, pažymėdamas, kad niekieno tapatybė neturi būti viešinama ir kad NIH jau finansuoja žmogaus genetikos projektus, kuriuose yra mažiau apsaugos priemonių.

Bažnyčia pripažįsta, kad intymių žinių apie savo DNR daugeliui žmonių gali būti per daug. Jūs neleidžiate savo vaikams naršyti interneto pornografijos svetainėse, sako jis, ir tam tikru mastu neleidžiate sau naršyti baisiausiose, šiurkščiausiose svetainėse. Jis tikisi, kad žmonės, užuot pasiekę savo neapdorotus genomus, turės profesionalų, kurie padės jiems interpretuoti informaciją.

Nepaisant federalinio finansavimo trūkumo ir etinių prieštaravimų, Church tęsia veiklą, įsitikinusi, kad sekos nustatymo technologijų pažanga paskatins asmeninio genomo projekto idėją į priekį – lygiai taip pat, kaip informacinių technologijų pažanga paskatino nepažįstamus žmones dalytis duomenimis taip, kaip niekas nesvajojo. kai prieš 30 metų debiutavo „Apple II“ su dviem diskeliais. Jis mano, kad sekvenatoriams tampant veiksmingesniems, o išlaidoms ir toliau mažėjant, asmeninė genomika pakils tokiu mastu, kokį dar tik nedaugelis įsivaizduoja.

Laimėjimas loterijoje
Praėjusį spalį X prizo fondas paskelbė 10 milijonų dolerių apdovanojimą už itin tikslių 100 žmogaus genomų sekų sukūrimą per 10 ar mažiau dienų, neišleidžiant daugiau nei 10 000 USD vienam genomui. Vienas iš pirmųjų dalyvių buvo 454, kuris planuoja sukurti dar mažesnius karoliukus, kurie, tikimasi, leistų jos aparatams nuskaityti dar daugiau DNR per paleidimą už maždaug tokias pačias išlaidas. Mums nereikia jokios naujos fizikos ar matematikos, kad pasiektume 1000 USD genomą, sako Rothbergas.

Neatsižvelgus į klausimą, kada ir ar kas nors pretenduos į X prizą, DNR sekos kaina tikrai ir toliau kris, o tikslumas didės. Iki praėjusių metų sekos nustatymui tikrai buvo sunku turėti įtakos kitai genomikos erai, kurią ji turėjo turėti, sako Davidas Bentley, vyriausiasis Illumina mokslininkas. Iš esmės tradicinės sekos kaina tiesiog nenukrito pakankamai greitai. Jis sako, kad dabar ši sritis yra daug optimistiškesnė nei buvo anksčiau. Naujos kartos sekos nustatymas turi atlikti didžiulį vaidmenį.

Klausytis, kaip mokslininkai pažymi galimybes, prilygsta klausytis loterijos laimėtojų. O individualizuota medicina, tokia kaip vėžio tyrimai ir gydymas, kuriuos Dana-Farber's Meyerson tikisi padėti, yra tik atskaitos taškas. Bentley teigia, kad naujieji sekvenatoriai atvers langus didžiulėse nekoduojančiose genomo srityse, kurios įjungia ir išjungia genus. Egholmas iš 454 pažymi, kad Žmogaus genomo projektas iš tikrųjų nenustatė kiekvienos paskutinės žmogaus DNR dalies; vis dar gali būti neatrastų genų, kuriuos galima rasti atliekant papildomą seką. Broad's Lander įsivaizduoja gausybę naujos informacijos apie tai, kas lemia, kad ląstelė skirstoma į vieną ar kitą tipą (pagrindinė vystymosi biologijos paslaptis) ir kas valdo skirtingas ląstelių būsenas. Suprantu, kad tai paaiškinti sunkiau nei išgydyti vėžį, sako jis, bet galiausiai tai svarbiau, nes tai turės įtakos visoms ligoms.

Landeris prognozuoja, kad per ateinančius metus mokslininkai galės pradėti tyrimus, kurie generuoja informacijos terabazes – vieną trilijoną As, Cs, Ts ir Gs. Aš niekada net neištariau žodžio terabazė prieš praėjusius metus, sako jis. Ir jei visi šie duomenys yra internete ir yra laisvai prieinami, tai paskatins visiškai kitokią biologiją.

Jonas Cohenas, San Diege gyvenantis laisvai samdomas rašytojas ir korespondentas Mokslas , kuria knygą, kurioje nagrinėjami genetiniai skirtumai, skiriantys šimpanzes nuo žmonių.

paslėpti