211service.com
Ląstelių kartografas
Avivas Regevas padėjo vienaląsčių genomikos pradininkui. Dabar ji vadovauja didžiulėms pastangoms nustatyti trilijonus žmogaus kūno ląstelių. Biologija niekada nebus tokia pati. 2018 m. rugpjūčio 22 d
Praėjusį spalį Avivas Regevas kalbėjosi su tarptautinių mokslininkų susirinkimu Izraelio Weizmanno mokslo institute. Regevui, MIT ir Harvardo plataus instituto skaičiavimo ir sistemų biologui, šis susibūrimas taip pat buvo savotiškas sugrįžimas į namus. 2002 m. Regev įgijo daktaro laipsnį netoliese esančiame Tel Avivo universitete. Dabar, praėjus 15 metų, ji grįžo aptarti vieno ambicingiausių projektų biologijos istorijoje.
Projektu „Žmogaus ląstelių atlasas“ siekiama sukurti atskaitos žemėlapį, kuriame būtų suskirstytos į kategorijas visos maždaug 37 trilijonai ląstelių, sudarančių žmogų. Žmogaus ląstelių atlasas dažnai lyginamas su Žmogaus genomo projektu – didžiuliu moksliniu bendradarbiavimu, kuris leido mums visiškai suprasti žmogaus DNR arba tai, kas gali būti laikoma nesutrumpinta žmogaus gyvenimo kulinarijos knyga. Tam tikra prasme atlasas yra to projekto darbų tąsa. Tačiau nors ta pati DNR kulinarinė knyga randama kiekvienoje ląstelėje, kiekvienas ląstelių tipas skaito tik kai kuriuos receptus, tai yra, ji išreiškia tik tam tikrus genus, vadovaudamasi jų DNR instrukcijomis, kad gamintų baltymus, kurie atlieka ląstelės veiklą. Žmogaus ląstelių atlaso pažadas yra atskleisti, kurie specifiniai genai yra išreikšti kiekvieno tipo ląstelėse ir kur galima rasti tuos genus ekspresuojančias ląsteles.
Kalbėdama savo kolegoms per susitikimą Izraelyje, Regev, kartu su Sarah Teichmann iš Wellcome Trust Sanger instituto pirmininkaujanti Žmogaus ląstelių atlaso organizaciniam komitetui, demonstravo niekšišką elgesį, kurio galite tikėtis iš žmogaus, vadovaujančio didžiuliam moksliniam darbui. . Projektas buvo vykdomas metus, o Regevas, MIT biologijos profesorius, kuris taip pat yra Broad fakulteto pirmininkas ir Klarmano ląstelių observatorijos ir ląstelių grandinių programos direktorius, peržiūrėjo naujai paskelbtą baltąją knygą, kurioje išsamiai aprašoma, kaip Tikimasi, kad ląstelių atlasas pakeis ligų diagnozavimo, stebėjimo ir gydymo būdus.
Regevai žengiant į baltąjį popierių, galimybės ėmė atrodyti beveik begalinės. Paprasčiausiu lygiu, kaip orientacinis žemėlapis, kuriame išsamiai aprašomi kiekvieno skirtingo tipo sveikų ląstelių išreikšti genai, Žmogaus ląstelių atlasas padės lengviau nustatyti, kaip genų ekspresija ir signalizacija sugenda ligos atveju. Tas pats žemėlapis taip pat galėtų padėti vaistų kūrėjams išvengti toksiškų šalutinių poveikių: tyrėjai, nusitaikę į geną, žalingą vienoje kūno dalyje, žinotų, ar tas pats genas atlieka gyvybiškai svarbų vaidmenį kitoje. Ir kadangi tikimasi, kad atlasas atskleis daug naujų ląstelių tipų, jis taip pat gali suteikti daug daugiau jautrumo standartiniam kraujo tyrimui, kuris tiesiog skaičiuoja skirtingus imuninių ląstelių pogrupius. Panašiai, pažvelgus į atskiras žarnyno ląsteles, galima gauti naujų įžvalgų apie specifines ląsteles, atsakingas už uždegimą ir maisto alergijas. Ir geresnis neuronų tipų supratimas gali turėti toli siekiančių pasekmių smegenų mokslui.
Pelės tinklainės ląstelių vaizdas, įskaitant naują jos laboratorijos nustatytą tipą – dviejų anksčiau žinomų tipų hibridą. Irene Whitney sutikimu
Galutinis produktas, pasak Regevas, bus ne kas kita, kaip periodinė mūsų ląstelių lentelė – įrankis, skirtas ne atsakyti į vieną konkretų klausimą, o padaryti įmanomus daugybę naujų atradimų. Ericas Landeris, Broad Institute įkūrėjas ir prezidentas bei Žmogaus ląstelių atlaso organizacinio komiteto narys, lygina tai su genomika. Žmonės iš pradžių manė, kad gali panaudoti genomiką šiai ar kitai programai, sako jis. Nieko nepavyko paversti genomika ir nieko nepavyks transformuoti turint ląstelių atlasą.
Korinio ryšio grandinės
Regev domėtis ląstelėmis prasidėjo Tel Avivo universitete, kur ji buvo viena iš maždaug 15 studentų, įstojusių į labai selektyvią programą, kuri suteikė jiems laisvę lankyti bet kurio dalyko aukšto lygio kursus. Pirmą dieną būdamas pirmakursis gali nuspręsti lankyti politikos mokslų magistrantūros studijas, sako ji.
Regev pirmą semestrą lankė genetikos kursą ir įsitraukė į skaičiavimo uždavinį – surasti tvarką sudėtinguose, tarpusavyje sujungtuose baltymų ir genų tinkluose kiekvienoje ląstelėje. Šią temą ji tęsė savo doktorantūros darbe, apibūdindama gyvas sistemas matematine kalba, kuri buvo sukurta kompiuteriniams procesams apibūdinti. 2002 m. baigusi daktaro laipsnį, ji buvo priimta į Harvardo Bauerio genomikos tyrimų centro programą, kuri leido įkurti savo laboratoriją, prieš tai nepasimokius postdoktorės.
Neilgai trukus Landeris, pradėjęs matematiko karjerą Oksforde studijavęs algebrinio kodavimo teoriją ir kombinatorinę matematiką, ieškojo talentingų žvaigždžių naujai sukurtam Broad Institute, kurio misija yra panaudoti genomiką žmonių ligoms ir ligoms tirti. padėti paspartinti jo gydymą. Pirmą kartą jis susitiko su Regevu per pietus Bauerio centre, per kurį kolegos pakaitomis kalbėjo apie savo tyrimus nuo penkių iki dešimties minučių. Kol apėjome visą stalą, aš buvau užrašęs „Išsamdykite Avivą Regevą“, – prisimena jis.
Landerio įtikintas prisijungti prie Broad po daugelio arbatos puodelių kavinėje „Algiers“ Harvardo aikštėje, Regevas ir toliau taikė skaičiavimo metodus, kad tyrinėtų neįtikėtinai sudėtingą ląstelės mechanizmą. Vieną ląstelę sudaro milijonai molekulių, kurios nuolat bendrauja, kai dirba kartu, kad atliktų viską, ką ląstelėms reikia: dalytis, augti, atitaisyti vidinius pažeidimus, o imuninių ląstelių atveju signalizuoti kitoms ląstelėms. grasinimai. Branduolio viduje DNR yra transkribuojama į RNR. Tai savo ruožtu sukelia baltymus, molekules, kurios atlieka darbą ląstelės viduje. Tuo tarpu ląstelės paviršiuje esantys baltymai nuolat gauna molekulines žinutes iš išorės – prieinama gliukozė, atvyko užpuolikas. Jie turi būti perduodami atgal į branduolio baltymus, kurie reaguos transkribuodami kitą DNR, sukurdami naujus baltymus ir dar daugiau signalizacijos tinklų.
Kiekviena ląstelė yra eksperimentas.
Bakas Squibbas
Tai tarsi sudėtingas kompiuteris, sudarytas iš daugybės skirtingų dalių, kurios sąveikauja viena su kita ir sako viena kitai, ką daryti, sako Regevas. Baltymų signalizacijos tinklai yra kaip grandinės, ir jūs galite galvoti apie elementą beveik kaip laidų schemą, sako ji. Tačiau norint suprasti jų veiklą naudojant skaičiavimo metodus, pirmiausia reikia surinkti didžiulį duomenų kiekį, kurį Regev jau seniai padarė per RNR seką. Skirtingai nei DNR sekos nustatymas, ji sako, kad ji gali jai pasakyti, kurie genai iš tikrųjų yra išreikšti, todėl suteikia daug dinamiškesnį veikiančios ląstelės vaizdą. Tačiau vien tik jos tiriamų ląstelių RNR seka gali pasakyti tik tiek. Kad suprastų, kaip grandinės keičiasi skirtingomis aplinkybėmis, Regev veikia ląsteles skirtingais dirgikliais, tokiais kaip hormonai ar patogenai, kad pamatytų, kaip keičiasi gaunami baltymų signalai.
Toliau ateina tai, ką ji vadina modeliavimo žingsniu – algoritmų kūrimu, kurie bando iššifruoti labiausiai tikėtiną molekulinių įvykių seką po dirgiklio. Ir lygiai taip pat, kaip kas nors gali tyrinėti kompiuterį, iškirpdamas grandines ir matydamas, kaip tai keičia mašinos veikimą, Regevas išbando savo modelį, norėdamas nuspėti, kas atsitiks, kai ji nutildys konkrečius genus ir tada paveiks ląsteles tuo pačiu dirgikliu.
2009 m. tyrime Regev ir jos komanda ištyrė, kaip patogenų, tokių kaip bakterijos, virusai ar grybeliai, molekulinių komponentų poveikis paveikė imuninės sistemos dendritinių ląstelių grandinę. Ji kreipėsi į techniką, žinomą kaip RNR trukdžiai (dabar ji naudoja CRISPR), kuri leido jai sistemingai išjungti genus. Tada ji pažvelgė, kurie genai buvo išreikšti, kad nustatytų, kaip kiekvienu atveju pasikeitė ląstelių atsakas. Jos komanda išskyrė 100 skirtingų genų, kurie dalyvavo reguliuojant atsaką į patogenus – kai kurie iš jų anksčiau nebuvo žinomi kaip susiję su imunine funkcija. Tyrimas, paskelbtas m Mokslas , sugeneruotos antraštės. Tačiau, pasak ilgametės kolegės Danos Pe'er, dabar Sloano Ketteringo instituto Sloan Kettering instituto Sloan Kettering vėžio centro memorialinio skaičiavimo ir sistemų biologijos vadovės ir Žmogaus ląstelių atlaso organizacinio komiteto narės, Regevą išskiria jos elegancija. dirbti. Regevas, sako Peer, turi retą, įgimtą gebėjimą matyti sudėtingą biologiją ir ją supaprastinti bei formalizuoti į gražius, abstrakčius, aprašomus principus.
Nuo kokteilių iki vaisių salotų
Regevo biure Plačiame institute yra daug tuščių kavos puodelių, tačiau jų labai mažai. Į mokslą ji artėja dalykiškai. Yra daug puikių žmonių, sako Landeris. Ji yra puikus žmogus, galintis atlikti reikalus.
Greitai kintančioje genomikos arenoje (2015-ieji mano srityje laikomi senąja istorija, sako ji) ji žinoma kaip maksimaliai išnaudojanti naujausias naujoves ir padedanti paskatinti naujas. Daugelį metų ji ir kiti šios srities darbuotojai kovojo su nešvaria RNR sekos nustatymo paslaptimi: nors jos pažadas visada buvo tikslumas – tikslaus kodo žinojimo galia – metodai davė rezultatų, kurie nebuvo specifiniai. Kiekviena ląstelė turi tik nedidelį kiekį RNR. Sekvenavimo tikslais RNR iš milijonų ląstelių turėjo būti sujungta. Masinis RNR sekos nustatymas tyrėjams paliko tai, ką ji prilygina kokteiliui. Kai jis sumaišomas, nėra galimybės atskirti visų į jį patekusių vaisių – arba šiuo atveju RNR iš atskirų ląstelių. Mokslininkams reikėjo kažko panašesnio į vaisių salotas, būdo atskirti visas mėlynes, avietes ir gervuoges.
2011 m., dirbdamas su Broad Institute kolega Joshua Levin, 1992 m. mokslų daktaru, Alexu Shaleku, dabar MIT Medicinos inžinerijos ir mokslo institute, ir Rahulu Satija, dabar dirbančiu Niujorko genomo centre, Regev sugebėjo gauti pakankamai RNR iš viena ląstelė, kad ją sektų. Norėdami išbandyti metodą, jie sekvenavo 18 atskirų dendritinių ląstelių iš pelės kaulų čiulpų. Visos ląstelės buvo gautos tokiu pačiu būdu ir tikimasi, kad jos bus to paties tipo. Tačiau mokslininkų nuostabai jie išreiškė skirtingus genus ir gali būti suskirstyti į du skirtingus potipius. Atrodė, lyg sužinotumėte, kad kokteilyje, kurį gėrėte daugelį metų, yra ingredientų, apie kuriuos niekada nežinojote.
Regev ir jos kolegos nebuvo vieninteliai, kurie sugalvojo, kaip suskirstyti vieną tokio jautrumo ląstelę, ir jie nebuvo pirmieji, kuriems pavyko. Kitos laboratorijos padarė panašią pažangą maždaug tuo pačiu metu, kiekviena naudojo savo technologiją ir algoritmus. Ir jie visi susidūrė su ta pačia problema: atskirti ir išskirti pakankamai RNR iš atskirų ląstelių buvo daug laiko ir brangu. Regev ir jos kolegos išleido daugybę tūkstančių dolerių, kad suskirstytų tik 18 ląstelių. Jei kūnas buvo pilnas retų, neatrastų ląstelių, jas rasti prireiks nepaprastai ilgai.
Regevo komanda išsamiai apibūdino pelės tinklainės lazdelių bipolines ląsteles (krislias) ir kūgines bipolines ląsteles (oranžinės spalvos), naudodama Drop-Seq technologiją, kurią jie padėjo išrasti. Irene Whitney sutikimu
Praleiskite septynerius metus ir vienos ląstelės RNR sekos nustatymo kaina nukris tik iki centų už ląstelę. Svarbus proveržis buvo Drop-Seq, nauja technologija, kurią sukūrė Harvardo ir Broad Institute mokslininkai, įskaitant Regevą ir jos laboratorijos narius. Prietaisas įterpia atskiras ląsteles į skirtingus aliejaus lašelius su mažyčiu brūkšniniu kodu pažymėtu rutuliuku. Kai ląstelė suskaidoma sekos nustatymui, dalis jos RNR prisijungia prie lašelio granulės. Tai leidžia tyrėjams vienu metu išanalizuoti tūkstančius, nesumaišant jų genetinės medžiagos.
Ląstelių teorija 2.0
Kai prieš maždaug 180 metų vokiečių mokslininkai pirmą kartą pasiūlė ląstelių teoriją, buvo sunku suprasti, kad mūsų audiniai yra sudaryti iš atskirų elementarių vienetų, kaip ląsteles apibūdino vienas iš dviejų mokslininkų, kuriems ši teorija priskiriama Theodor Schwann. Tačiau netrukus tai tapo pagrindiniu biologijos principu, o bėgant dešimtmečiams ir amžiams ląstelės pradėjo atsisakyti savo paslapčių. Mikroskopai patobulinti; atsirado naujų dažymo ir rūšiavimo būdų. Su kiekvienu pažanga tapo įmanomi nauji skirtumai. Raumenų ląsteles galima atskirti nuo neuronų ir vėl priskirti lygiųjų arba skeleto raumenų ląsteles. Ląstelės, kaip paaiškėjo, buvo iš esmės panašios, tačiau buvo skirtingų formų, kurios turėjo skirtingas savybes.
Iki XXI amžiaus buvo nustatyta 200–300 pagrindinių ląstelių tipų. Ir nors biologai jau seniai pripažino, kad tikrasis ląstelių tipų skaičius turi būti didesnis, jų įvairovės mastas išryškėja tik dabar, daugiausia dėl vienos ląstelės RNR sekos nustatymo. Regevas teigia, kad vien imuninę sistemą dabar galima suskirstyti į daugiau nei 200 ląstelių tipų ir kad net mūsų tinklainėje yra 100 ar daugiau skirtingų neuronų tipų. Ji ir jos kolegos atrado keletą jų.
Idėja, kad žinant tiek daugiau apie mūsų ląsteles, galima pasiekti medicininių proveržių, nebėra hipotetinė. Pastaraisiais metais nustatydama atskirų vėžio ląstelių RNR seką – dabar kiekviena ląstelė yra eksperimentas, – sako ji, – ji aptiko nepaprastų skirtumų tarp vieno naviko ląstelių, net kai jos turi tas pačias mutacijas. (Praėjusiais metais šis darbas paskatino Sloan Kettering memorialą Paulo Markso premija už vėžio tyrimus .) Ji išsiaiškino, kad nors manoma, kad kai kurios vėžio formos turi atsparumą terapijai, dalis melanomos ląstelių buvo atsparios nuo pat pradžių. Ir ji atrado, kad dviejų tipų smegenų vėžys, oligodendroglioma ir astrocitoma, turi tas pačias vėžio kamienines ląsteles, kurios gali turėti svarbių pasekmių jų gydymui.
Kaip mes kada nors įsivaizdavome, kad išspręsime problemą be vienos ląstelės skiriamosios gebos?
Regevas taip pat aktyviai kartojo ląsteles iš imuninės sistemos, smegenų, žarnyno ir kitur. Ji ne viena. Kitos laboratorijos pradėjo savo žemėlapių sudarymo projektus, kurių kiekviena sprendžia skirtingą kūno dalį. Praėjusiais metais Vašingtono universiteto mokslininkai bandė klasifikuoti kiekvieną mikroskopinio kirmino ląstelių tipą C. elegans . Kiekviena biologijos sritis sako: „Žinoma, turime pažvelgti į vienos ląstelės skiriamąją gebą“, - sako Landeris. Kaip mes kada nors įsivaizdavome, kad išspręsime problemą be vienos ląstelės skiriamosios gebos?
Jaudulys lauke tapo apčiuopiamas, nes buvo rasta daugiau naujų ląstelių tipų. Ir vis dėlto Regevas suprato, kad jei siekiama visapusiškų žinių, požiūris turi būti derinamas. Jei kiekviena laboratorija remtųsi savo metodais, būtų sunku standartizuoti skaičiavimo įrankius ir gautus duomenis. Regevas sako, kad nauji tyrimai išryškino labai gražius šviesos blyksnius – daiktas čia, daiktas ten. Tačiau ji norėjo įsitikinti, kad šie atradimai gali būti susiję.
Regevas pradėjo propaguoti kažko vieningesnio kūrimą: žemėlapį, kuris leistų tyrėjams nustatyti genų ekspresiją ir ląstelių tipus visame kūne. Sarah Teichmann galvojo panašiai. Kai 2015 m. pabaigoje ji susisiekė su Regev dėl galimybės suvienyti jėgas, Regeva iškart pasakė „taip“.
„Google“ žemėlapiai mūsų ląstelėms
Žmogaus ląstelių atlasas yra šimtų biologų, technologų ir programinės įrangos inžinierių visame pasaulyje bendradarbiavimas. Vienos ląstelės RNR sekos nustatymo rezultatai bus derinami su kitais duomenų taškais, kad būtų pateiktas išsamus visų žmogaus ląstelių katalogas.
Tačiau daugelis dalyvaujančių mokslininkų ne tik sudarys skaičiuokles, kuriose pateikiami skirtingi ląstelių tipai. Atlasas taip pat atskleis, kur ląstelės yra organizme, kiek jų yra, kokiomis formomis jos gali būti, net skirtingų ląstelių tipų vystymosi istorija, kaip jos skiriasi nuo kamieninių ląstelių. Ir visa tai bus pasiekiama naudojant duomenų koordinavimo platformą ir turtingą vaizdinę sąsają, kurią Regev lygina su „Google Maps“. Tai leis vartotojams priartinti mūsų ląstelių molekulinį lygį, tačiau taip pat bus svarbu priartinti iki audinių ir organų lygio. Kaip pažymėjo projekto organizacinio komiteto 2017 m. Žmogaus ląstelių atlaso apžvalga, atlasas yra žemėlapis, kuriuo siekiama parodyti ryšius tarp jo elementų. Lygiai taip pat, kaip atitinkamos pakrantės, matomos Žemės atlase, rodo vaizdinius žemyno dreifo įrodymus, taip pat surinkus visus duomenis apie mūsų ląsteles vienoje vietoje, būtų galima atskleisti ryšius tarp ląstelių, audinių ir organų, įskaitant kai kuriuos visiškai netikėtus. Ir kaip periodinė lentelė leido nuspėti elementų, kurių dar reikia stebėti, egzistavimą, Žmogaus ląstelių atlasas, anot Regev, gali padėti mums numatyti nerastas ląsteles.
Ciliarinis kūnas (viršuje kairėje) pelės tinklainės pakraštyje (viršuje dešinėje) gali būti imuninių ląstelių, reaguojančių į tinklainės neuronų pažeidimą, įėjimo taškas. Irene Whitney ir Grace Burgin sutikimu
Planas yra ne sekti visas 37 trilijonus ląstelių, o paimti mėginius iš kiekvienos kūno dalies. Regev kalbant apie projektą, jos entuziazmas akivaizdus, ji iškasa skaidrę, kad parodytų, koks efektyvus gali būti mėginių ėmimas. Skaidrė, iš pradžių tik tuščias baltos spalvos rėmelis, po pikselio pradeda pildytis mėlynomis ir geltonomis dėmėmis. Netrukus, nors daugelis pikselių dar neužpildyti, vaizdas ekrane yra neabejotinas: tai Van Gogho Žvaigždėta naktis . Regevas taip pat paaiškina, kad žmogaus ląstelių atlasas gali pateikti išsamų vaizdą, net jei ne kiekviena ląstelė buvo sekvenuota.
Norėdami nustatyti seką, Regevas ir Teichmannas pasveikino ir įdarbino kiekvieno skirtingo audinio tipo ekspertus. Nors tikimasi, kad užtruks ne vienerius metus, projektas sparčiai juda į priekį su tokiais rėmėjais kaip NIH, ES, Wellcome Trust, Mantono fondas ir Chano Zuckerbergo iniciatyva , kuri įsipareigojo per ateinantį dešimtmetį išleisti 3 milijardus dolerių kovai su ligomis; vien šiais metais ji finansuos 85 žmogaus ląstelių atlaso dotacijas. Pirmieji rezultatai jau sklinda. Kovo mėn. Švedijos mokslininkai, dirbantys su žmogaus vystymusi susijusiomis ląstelėmis, paskelbė, kad sekvenavo 250 000 atskirų ląstelių. Gegužės mėnesį Broad komanda peržiūros svetainėje paskelbė daugiau nei 500 000 imuninių ląstelių duomenų rinkinį. Regevas teigia, kad tikslas yra, kad mokslininkai visur galėtų naudoti žmogaus ląstelių atlaso atvirojo kodo platformą bendrai analizei atlikti.
Atlasas gali tapti realybe, dar liko daug iššūkių. Turi būti sukurta nauja vizualizavimo programinė įranga. Sekvencijos ir skaičiavimo metodai turės būti standartizuoti daugelyje laboratorijų. Reikia išspręsti konceptualius klausimus, pvz., kuo skiriasi vienas ląstelių tipas nuo kito. Tačiau bendruomenei už Žmogaus ląstelių atlaso, įskaitant daugiau nei 800 asmenų birželio mėn., motyvacijos netrūksta.
Vienas iš naujausių Regevo tyrimų, paskelbtų rugpjūčio mėn Gamta , galbūt geriausias pavyzdys, kaip projektas gali pakeisti biologiją. Atlikdami plaučių ląstelių kartografavimą, Regev ir Jay Rajagopal laboratorija Masačusetso bendrojoje ligoninėje aptiko naują, labai retą ląstelių tipą, kuris pirmiausia išreiškia geną, susijusį su cistine fibroze. Regevas dabar mano, kad šios retos ląstelės tikriausiai vaidina pagrindinį vaidmenį sergant liga. Dar labiau stebina tai, kad mokslininkai anksčiau manė, kad geną išreiškia kitoks ląstelių tipas.
Įsivaizduokite, jei kas nors norėtų atlikti genų terapiją, sako Regevas. Jūs turite pataisyti geną, bet turite jį pataisyti tinkamoje ląstelėje. Žmogaus ląstelių atlasas galėtų padėti tyrėjams identifikuoti tinkamą ląstelę ir suprasti, kaip aptariamas genas yra reguliuojamas tos ląstelės nepaprastai sudėtingų molekulinių tinklų.
Regevui žmogaus ląstelių atlaso svarba viršija pažadą pakeisti biologiją ir mediciną. Kaip ji kartą pasakė, be savo ląstelių atlaso mes iš tikrųjų nežinome, iš ko esame pagaminti.